Kan glyfosat ersätta glycin i proteiner för att aktivt dela däggdjursceller?

av Stephanie Seneff

18 Augusti 2019

Ett papper publicerades nyligen av Antoniou et al. med den djärva titeln “Glyfosat ersätter inte glycin i proteiner från aktivt uppdelande däggdjursceller.” [1]. Uppsatsen involverade exponering av mänskliga bröstcancerceller för glyfosat under sex dagar, och användes sedan en sofistikerad teknik som heter Tandem Mass Tag (TMT) för att identifiera korta peptider som påstås innehålla anomalt tunga glycinmolekyler. Proteiner från både de behandlade och obehandlade cellerna sattes genom ett standardprotokoll innefattande masspektrometri, partiell proteolys och ytterligare analys, såsom beskrivs i papperet.

Cellerna bibehölls på en rik näringsformulering kallad Dulbeccos modifierade örnmedium. Denna formulering är en modifiering av den ursprungliga Basal Medium Eagle som är fyrfaldig berikad med aminosyror och vitaminer. Det har också en hög koncentration av glukos vid 4500 mg / L. Det finns ingen garanti för att det inte är kontaminerat med glyfosat. Dessutom hade cellerna odlats i kultur under en viss tid som inte var avsedda tidigare, och de hade troligen ackumulerat ett betydande antal felvikta glyfosatkontaminerade proteiner som var svåra att rensa. De började troligen sitt liv i kulturen redan med glyfosatkontaminerade proteiner, genom livstids exponering för glyfosat hos människan som ursprungligen hamnade dessa celler i en mammatumör.

Författarna testade proverna för två olika post-translationella modifieringar (PTM): glyoxylat-modifierad cystein och glyfosatsubstitution för glycin. De inkluderade glyoxylatmodifieringen eftersom de antagde att glyfosat kan brytas ner till glyoxylat, vilket kan binda till cysteinrester. Noterbart upptäckte de inga glyoxylatmodifierade cysteiner i varken kontrollcellerna eller de behandlade cellerna.

Däremot fann författarna en betydande signal för glyfosat-närvaro i flera korta peptider i de behandlade proverna. Men de fann också en lika stark signal i de obehandlade proverna. De skrev: “I detta experiment förväntades emellertid ingen av de två förmodade PTM: erna (post-translationell modifiering) av intresse vara närvarande i frånvaro av glyfosatbehandling. Det var således möjligt att använda TMT-märkning för att identifiera och filtrera bort eventuella potentiella falska upptäckter. “” Och sedan: “” Uppgifterna visar slutligen att alla kandidatersubstituerade peptider är falska upptäckter.”

Ett lika troligt argument är emellertid att de “obehandlade” cellerna också har glyfosatsubstituerade proteiner. Potentiellt är de flesta om inte alla kandidatersubstituerade peptider verkliga upptäckter. Eftersom både de behandlade och kontrollcellerna hade exponerats för glyfosat under en lång tid tidigare, är det troligt att de båda hade ackumulerat glyfosatförorenade proteiner i nästan lika stora mängder. Anthony Samsel och jag diskuterade i vårt första uppsats om glyfosatsubstitution för glycin bevis som N-substituerade glyciner kan bilda peptoider som är mycket svåra att bryta ner, och att fosfonater har visat sig ha en förmåga att hämma proteolys [2].

Tanken på att exponering för glyfosat resulterar i ansamling av proteolysresistenta proteiner stöds av en studie publicerad 2013 på ärtplantor [3]. Författarna observerade en ansamling av ubiquitinerade proteiner tillsammans med uppreglering av proteolysenzymer, vilket är överraskande och ovanligt. De skrev:

“Uppsamlingen av ubiquitinerade proteiner, tillsammans med ökad förmodad proteasomaktivitet observerades genom ABPP [Aktivitetsbaserad proteinprofilering], vilket indikerar en roll för proteasomen vid herbicidbehandling. Ackumulering av ubiquitinerade proteiner har typiskt beskrivits i samband med en samtidig minskning i proteasomaktivitet. Ändå visade våra resultat ökningar i både proteasomsubstratnivåer och aktiviteter. Således kan den herbicidinducerade stressen på proteomet resultera i ansamling av ubikitinerade proteiner, trots den ökade proteasomaktiviteten, eller den ökade tillgängligheten av substratet kan framkalla proteasomaktivitet. ”

En trolig förklaring är att glyfosat inbäddat i proteinerna stör de proteolytiska enzymernas förmåga att bryta ner det. I ett papper som länkar glyfosat till Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) beskrev vi faktiskt hur glyfosat skulle kunna störa ubiquitineringsprocessen själv, vilket markerar proteiner för borttagning av proteasomen [4]. Vi skrev:

“Mest spännande är det faktum att ubiquitin själv beror kritiskt på ett mycket konserverat karboxiterminal dubbelglycinpar för att bygga de komplexa ubiquitinkedjorna som signalerar ett protein för nedbrytning [46] [återges här som [5]]. Substitution av glyfosat för endera av dessa väsentliga glyciner kan förväntas försämra processen för återvinning av felvikta proteiner. Detta kan lätt förklara ansamlingen av felvikta proteiner som är ett kännetecken för ALS.”

Lyckligtvis för oss, Antoniou et al. [1] gav i sin tabell 3 de exakta sekvenserna med glyfosatsubstitutioner som upptäcktes, och Uniprot-webbplatsen ger ett verktyg där man kan hitta proteiner som innehåller specifika sekvenser med ett mjukvarupaket som heter BLAST. Uniprot kunde hämta identiteten för alla de 15 proteinerna som tillhandahölls som träffar i deras figur 3, med en exakt matchning till en sekvens som var närvarande i varje protein. Alla 15 proteinerna var humana proteiner. Åtminstone nio av dessa proteiner binder till fosfatinnehållande molekyler, såsom anges i tabell 1. Detta ger stöd för idén att proteiner som binder fosfat är särskilt mottagliga för substitution av glyfosat, vilket framgår av en nyligen publicerad artikel publicerad av Gunatilake et al. [6] och föreslår att glyfosat är en viktig faktor i kronisk njursjukdom av okänd etiologi (CKDu) bland jordbruksarbetare på Sri Lanka. I själva verket innehåller proteinet EPSP-syntas i växter som tros vara huvudmålet för glyfosat i att döda ogräs, en mycket konserverad glycinrest på platsen där fosfoenolpyruvat (PEP) binder. Forskare från DowDupont har kunnat använda CRISPR-teknik för att skapa en stam av majs som är resistent mot glyfosat på grund av en CRISPR-modifierad gen för EPSP-syntas [7]. Det första steget de gjorde var att ändra DNA-koden för att ersätta glycin på PEP-bindningsstället med alanin. Detta resulterade i en version av enzymet som var helt okänsligt för glyfosat.
Tabell 1: Nio proteiner innehållande glyfosatsubstituerade peptider, identifierade med användning av Tandem Mass Tag (TMT) -spektrometriverktyg. Dessa peptider, tillsammans med ytterligare 6, hittades i cancerceller odlade i kultur. Alla nio binder till fosfatinnehållande molekyler som anges i den tredje kolumnen. Den första kolumnen ger den detekterade sekvensen, där “*” indikerar en glycinrest som visade sig vara substituerad. Se: Antoniou et al. (2019) för detaljer om den experimentella installationen.

Sekvens Protein Namn Fosfatinnehållande substrat
AIRQTSELTLG*K  Zinkfingerprotein 624 DNA
DG*QDRPLTKINSVK Pleckstrin-homologi domäninnehållande familj A-medlem 5 Fosfatidylinositolfosfat
EPVASLEQEEQG*K  Dubbel homeobox protein A DNA
G*ELVMQYK  Diacylglycerolkinas-gamma ATP
GKELSG*LG*SALK Mycket långkedjespecifikt acyl-CoA-dehydrogenas-mitokondriell
FAD
KDGLG*GDK G-proteinkopplad receptor 158 GTP
NEKYLG*FGTPSNLGK ATP-beroende Clp-proteas ATP-bindande underenhet ATP
RTVCAKSIFELWG*HGQSPEELYSSLKtRNA (guanin (10) -N2) metyltransferas-homolog
tRNA
VTG*QLSVINSK Protein O-mannosyl-transferas 2 (Q9UKY4) dolichylfosfat

Sammantaget avslöjar tabell 1 en spännande lista över humana proteiner, och många av dem kan förväntas uttryckas i bröstcancerceller. Till exempel är ett ett RNA-metyleringsprotein (tRNA (guanin (10) -N2) -metyltransferas-homolog). En annan har tumörundertrycksfunktion genom Akt-hämning, genom att binda till fosfatidylinositolfosfater (Pleckstrin-homologidomininnehållande familj A-medlem 5). En annan är en G-protein-kopplad receptor (GPCR). Enligt Bar-Shavit et al. “GPCR kontrollerar många funktioner hos tumörigenes, inklusive immuncellmedierade funktioner, proliferation, invasion och överlevnad på det sekundära stället.” [8] En annan hit är ett homeoboxprotein, och denna klass av proteiner tros specifikt spela en kausal roll i bröstcancer [9].

En annan viktig upptäckt från detta dokument är de två proteinerna som identifierades som statistiskt signifikant uppreglerade som svar på den sex dagar långa glyfosatbehandlingen. Dessa är: ADP / ATP-nukleotidtranslokas (ANT) och serin / argininrik skarvningsfaktor 6 (SRSF6) [1]. Dessa två proteiner visar sig vara mycket intressanta, eftersom båda är kända för att vara överuttryckta i tumörceller, och i båda fallen är högre nivåer av dessa proteiner kopplade till dåligt resultat hos cancerpatienter.

SRSF6 är en medlem av familjen av skarvfaktorer som har kraftfulla förmågor att förändra proteinuttryck genom att modifiera hur peptider samlas från enskilda exoner. Överuttryck av SRSF6 i lungepitelceller förbättrade spridningen, skyddade dem från kemoterapi och ökade deras förmåga att bilda tumörer [10]. Vidare minskade knockdown av SRSF6 i lung- och koloncancercellinjer deras tumörpotential. SRSF6 uttrycks ofta i hudcancer, och det förändrar skarvningen av ett protein som kallas tenascin C för att främja invasiv och metastaserande cancer [11]. SRSF6 orsakar också överdriven spridning av keratinocyter, ett kännetecken för psoriasis [12]. Om glyfosat orsakar att SRSF6 uppregleras i bröstcancerceller orsakar det troligtvis förstärkt tumörgenes hos exponerade människor.

ANT finns i flera olika isoformer med olika effekter på cellbiologi, men den som uttrycks starkt i bröstcancerceller är ANT2, och det har visat sig vara viktigt för att upprätthålla tumöröverlevnad. ANT2: s jobb är att transportera ATP till mitokondrierna, och denna aktivitet är viktig när en cell arbetar under antaganden om Warburg-effekten. Cancerceller producerar mycket av deras ATP i cytoplasma genom glykolys, och sedan bär ANT2 ATP in i mitokondrierna så att de kan minska mängden ATP de behöver för att producera genom oxidativ fosforylering. Detta är en bra strategi för att skydda mot oxidativ skada, särskilt när mitokondrier kan vara dysfunktionella på grund av DNA-mutationer som uppstått av toxiska exponeringar. ANT2 programmerar faktiskt en cell för att implementera strategier som leder till ökad spridning snarare än apoptos (celldöd) i närvaro av stressfaktorer [13]. Det har nyligen intresserat sig för att utveckla läkemedel som bekämpar cancer genom att undertrycka ANT2-aktivitet [14].

Antoniou et al. papper kan vara ett betydande genombrott i vår strävan efter ett förfarande för att upptäcka glyfosatkontaminering i proteiner. Det är anmärkningsvärt att de kunde identifiera 15 humana proteiner som verkar ha modifierats genom glyfosatsubstitution med en specifik glycinrest. Papperet är av stort värde för samhället i stort, eftersom det anger en föreskriven procedur som nu kan tillämpas ganska rutinmässigt på flera andra celltyper som odlas i kultur, såväl som på biologiska prover extraherade från sjuka vävnader i däggdjur, till exempel naglar av sklerodermipatienter, hudceller hos psoriasispatienter, hårprover av autistiska barn, hovar av hästar som lider av grundare, tumörbiopsier, Alzheimers plack postmortem, sjuka njur- och levervävnader etc.

Framtida möjligheter att upptäcka glyfosatförorenade proteiner finns i överflöd, och när vi samlar en databas med specifika substitutionsmönster kan vi till och med kunna förutsäga regler för peptidsammanhang där glycinrester är särskilt mottagliga, till exempel när angränsande aminosyror är små (för att förhindra steriskt hinder) eller positivt laddad (för att locka glyfosat till platsen för peptidmontering på grund av dess negativa laddning). I själva verket är dessa typer av regler redan uppenbara i den lilla uppsättningen som återfinns i Antoniou et al. experimentera. Sex av de 15 påstådda substituerade glycinerna följdes omedelbart av en positivt laddad aminosyra (lysin, histidin eller arginin). Och tio föregicks omedelbart av en av valin, leucin, serin eller treonin, som alla är små aminosyror, vilket ger utrymme för glyfosats metylfosfonylsvans. Om glyfosat verkligen ersätter glykin under proteinsyntes, är konsekvenserna med sinneskydd, och de lumvande kumulativa toxiska effekterna av glyfosat kan lätt förklara den ökning vi ser idag i förekomsten av en lång lista med autoimmuna, metaboliska, neurologiska och onkologiska sjukdomar.

Referenser

[1] MN Antoniou et al. Glyfosat ersätter inte glycin i proteiner från aktivt uppdelande däggdjursceller. BMC Res Notes 2019; 12: 494. (Webblänk)
[2] A Samsel och S Seneff. Glyfosat, vägar till moderna sjukdomar V: Aminosyraanalog av glycin i olika proteiner. Journal of Biologisk fysik och kemi 2016; 16: 9-46. (Webblänk) (nedladdning)
[3] A Zulet et al. Proteolytiska vägar inducerade av herbicider som hindrar aminosyrabiosyntes. PLoS ONE 2013; 8 (9): e73847. (Webblänk)
[4] S Seneff et al. Bidrar glyfosat som fungerar som en glycinanalog till ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2 (3): 1-21. (Webblänk) (nedladdning)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signalering: Extrem bevarande som en källa till mångfald. Celler 2014; 3 (3): 690-701. (Webblänk)
[6] S Gunatilake et al. GlyphosateтА: s synergistiska toxicitet i kombination med andra faktorer som en orsak till kronisk njursjukdom av okänt ursprung. Int J Environ Res Public Health 2019; 16 (15). pii: E2734. (Webblänk) (nedladdning)
[7] Y Dong et al. Desensibiliserande växt EPSP-syntas till glyfosat: Optimerad global sekvenskontext rymmer en glycin-till-alaninförändring på det aktiva stället. J Biol Chem 2019; 294 (2): 716-725. (Webblänk)
[8] R Bar-Shavit et al. G proteinkopplade receptorer i cancer. Int J Mol Sci 2016; 17 (8). pii: E1320. (Webblänk)
[9] MT Lewis. Homeobox-gener i bröstkörtelutveckling och neoplasi. Bröstcancerforskning 2000; 2: 159. (Weblink)
[10] M Cohen-Eliav et al. Skarvningsfaktorn SRSF6 förstärks och är ett oncoprotein i lung- och koloncancer. J Pathol 2013; 229 (4): 630-9. (Webblänk)
[11] MA Jensen et al. Skarvningsfaktor SRSF6 främjar hyperplasi av sensibiliserad hud. Nat Struct Mol Biol 2014; 21 (2): 189197. (Weblink)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: en sjukdom med onormal Keratinocytproliferation inducerad av T-lymfocyter. Immunol Today 1986; 7 (9): 256-9. (Webblänk)
[13] SH Baik och J Lee. Adeninnukleotidtranslokas 2: en ny spelare i cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1 (2): 66-68. (Webblänk)
[14] J-Y Jang et al. Undertryckning av adeninnukleotidtranslokas-2 genom vektorbaserad siRNA i humana bröstcancerceller inducerar apoptos och hämmar tumörtillväxt in vitro och in vivo. Bröstcancerforskning 2008; 10 (1): R11. (Webblänk)


Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *